Nghiên cứu metagenome của một số hệ sinh thái mini tiềm năng nhằm khai thác các gen mới mã hóa hệ enzyme chuyển hóa hiệu quả lignocellulose

Chủ nhiệm đề tài TS. Đỗ Thị Huyền
Đơn vị thực hiện Viện Công nghệ Sinh học
Thời gian thực hiện 2014 - 2017
Thuộc chương trình Đề tài độc lập cấp nhà nước - Mã số: ĐTĐLCN.15/14
Cán bộ tham gia Viện Công nghệ sinh học
Tổng kinh phí 5235 triệu đồng
Xếp loại đề tài Xuất sắc
Mục tiêu đề tài

- Xây dựng được cơ sở dữ liệu DNA metagenome của các vi sinh vật từ ba hệ sinh thái mini (bao gồm hệ sinh thái mini từ khu hệ vi sinh thủy phân lignocellulose mạnh, hệ vi sinh trong ruột dê và hệ vi sinh từ suối nước nóng).
- Phát hiện ra các gen mới mã hóa cho hệ enzyme tham gia quá trình chuyển hóa lignocellulose.
- Tách dòng và biểu hiện một số gen mới mã hóa cho hệ enzyme chuyển hóa hiệu quả lignocellulose.

Kết quả đạt được

Về khoa học:
- Các hệ mini sinh thái tiềm năng đã được thu thập bao gồm 45 mẫu ở vùng thủy phân lignocellulose mạnh tại vườn quốc gia Cúc Phương, 10 con dê chăn thả ở Ninh Bình, Thanh Hóa, Ba Vì và 14 mẫu ở suối nước nóng Bình Châu và lựa chọn được một mẫu nấm mục trắng Trametes vesicolor có khả năng chuyển hóa lignocellulose mạnh nhất. Vi khuẩn tổng số từ dạ cỏ dê, mẫu đất xung quanh nấm mục trắng và suối nước nóng Bình Châu đã được tách chiết với chất lượng cao và giải trình tự DNA metagenome, mRNA từ mẫu nấm đã được tách chiết và giải trình tự transcriptome.
- Dữ liệu giải trình tự DNA metgenome của vi khuẩn trong dạ cỏ dê, đất xung quanh khu nấm mục trắng phân hủy gỗ và suối nước nóng Bình Châu đều có kích thước đạt 8-9 GB và cơ sở dữ liệu cDNA của nấm có kích thước 4,5 GB.
- Tổng số 4725 trình tự mã hóa cho các nhóm enzyme tham gia tiền xử lý sinh khối, cellulase, hemicellulase trong đó có ít nhất 30% gen hoàn thiện. Trong số các trình tự này có khoảng 94% trình tự có độ tương đồng thấp dưới 85%.
- Đã phân lập được 2 gen mới (có độ tương đồng về trình tự nucleotide với trình tự trên ngân hàng gen NCBI dưới 79%) mã hóa licheninase, xylan beta xylosidase từ DNA metagenome của vi khuẩn trong đất. Đã biểu hiện 11 gen mã hóa cho các enzyme khác nhau tham gia trong chuỗi thủy phân lignocellulose và có 6 trình tự được biểu hiện tốt trong E. coli bao gồm gen mã hóa endo glucanase 1 (enzyme kiềm), endoglucanase 2 (enzyme axit) ở suối nước nóng Bình Châu, gen mã hóa expansin, endo xylanase và anpha glucuronidase từ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome của vi khuẩn dạ cỏ dê. Năm enzyme sau tinh chế thành công.
- Năm enzyme sau khi tinh chế đã được xác định đặc điểm. Các enzyme đều có tính đặc hiệu cơ chất cao trong đó endo xylanase hoạt động ở pH trung tính hơi ngả axit, endoglucanase 2 có hoạt tính tốt ở pH axit, anpha glucuronidase hoạt động tốt ở pH trung tính còn endoglucanase 1, beta glucosidase hoạt động ở pH kiềm. Endo glucanase axit có nhiệt độ tối ưu cao (65oC), anpha glucuronidase hoạt động ở nhiệt độ 30oC còn các enzyme khác hoạt động ở nhiệt độ ấm. Mecaptoethanol và triton làm tăng hoạt tính anpha glucuronidase, Ca++, Mg++ làm tăng hoạt tính endoglucanse1, Ca++ làm tăng hoạt tính endoglucanase 2, và Ni++ làm tăng hoạt tính beta glucosidase.
Về ứng dụng:

Một số hình ảnh của đề tài: 

dthuyen1

dthuyen2

Những đóng góp mới

- Đề tài đã tạo được 4 dữ liệu các trình tự của DNA metagenome vi khuẩn trong dạ cỏ dê, vi khuẩn từ suối nước nóng Bình Châu, vi khuẩn trong đất xung quanh khu nấm mục trắng phân hủy lignocellulose với kích thước trên 8 G và cDNA của nấm mục trắng với kích thước lớn trên 5 G. Từ dữ liệu này chúng tôi đã có được bộ dữ liệu của 4725 khung đọc mở (ORFs) được ước đoán mã hóa enzyme tham gia thủy phân lignocellulose. Ngoài gen mã hóa lignocellulase ra, có rất nhiều gen mã hóa cho các enzyme có giá trị trong làm sạch môi trường, trong công nghiệp đã được nhìn thấy nhưng chưa được khai thác. Đây là nguồn gen quí có thể khai thác cho các mục đích khác nhau.
- Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam và trên thế giới đã đánh giá được vai trò của vi khuẩn dạ cỏ dê chăn thả của Việt Nam trong việc chuyển hóa lignocellulose trong đó khẳng định vai trò của Bacteroidetes:Firmicutes trong việc chuyển hóa hemicellulose và tiền xử lý sinh khối.
- Lần đầu tiên ở Việt Nam và trên thế giới đã khai thác được nhiều loại gen tham gia phân cắt nhánh trong cấu trúc hemicellulose trong hệ vi khuẩn dạ cỏ dê. Trong đó nhiều gen có cấu trúc module đặc thù đã được tìm kiếm. Các endoglucanase GH9 thường có chứa vùng giống phân tử kháng thể Ig trong khi đó hầu hết các beta glucosidase GH3 lại có thêm domain FN3, và 10% xylanase có chứa vùng CBM. Các vùng này có thể giúp enzyme cố định tốt lên cơ chất để thủy phân cơ chất.
- Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam sử dụng probe từ trình tự đã được nghiên cứu để khai thác lựa chọn gen từ dữ liệu DNA metagenome. Do vậy số lượng gen biểu hiện có hoạt tính sinh học tăng lên. Bằng probe, chúng tôi đã tìm kiếm được một gen mã hóa expansin duy nhất từ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome của vi khuẩn trong dạ cỏ dê mà các công cụ ước đoán chức năng khác không tìm kiếm được. Gen mới không tương đồng với bất cứ gen nào trên ngân hàng gen NCBI nhưng trình tự amino acid suy diễn từ gen tương đồng 72% so với expansin mã số (SFW30713.1) có nguồn gốc từ R. flavefaciens với độ bao phủ 99%. Expansin đã được biểu hiện trong E. coli và có hoạt tính làm tăng khả năng thủy phân cellulose tinh thể trong cơ chất giấy lọc.

Sản phẩm

Các bài báo đã công bố (liệt kê):

1. Thi Huyen Do, Ngoc Giang Le, Trong Khoa Dao, Thi Mai Phuong Nguyen, Tung Lam Le, Han Ly Luu, Khanh Hoang Viet Nguyen, Van Lam Nguyen, Lan Anh Le, Thu Nguyet Phung, Nico M. van Straalen, Dick Roelofs, Nam Hai Truong (2018) Metagenomic insights into lignocellulose-degrading genes through Illumina-based de novo sequencing of the microbiome in Vietnamese native goats rumen. Journal of General and Applied Microbiology. 64(3):108-116.
2. Thi Huyen Do, Trong Khoa Dao, Khanh Hoang Viet Nguyen, Ngoc Giang Le, Thi Mai Phuong Nguyen, Tung Lam Le, Thu Nguyet Phung, Nico van Straalen, Dick Roelofs, Nam Hai Truong (2018) Metagenomic analysis of bacterial community structure and diversity of lignocellulolytic bacteria in Vietnamese native goat rumen. Asian-Australasian Association of Animal Sciences. 31(5):738-747.
3. Lê Ngọc Giang, Lưu Hàn Ly, Nguyễn Mai Phương, Lê Tùng Lâm, Đỗ Thị Huyền, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2017) Nghiên cứu phương pháp tách chiết DNA metagenome hệ vi khuẩn trong dạ cỏ dê. Tạp chí Công nghệ sinh học 15(2): 367-372.
4. Nguyễn Minh Giang, Đỗ Thị Huyền, Phùng Thu Nguyệt, Nguyễn Thị Trung, Trương Nam Hải (2017) Xây dựng probe để khai thác và chọn gen mã hóa xylan 1-4 beta xylosidase từ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome. Tạp chí Công nghệ sinh học 15(3): 451-460.
5. Nguyễn Minh Giang, Đỗ Thị Huyền, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2018) Xây dựng probe để khai thác và chọn gen mã hóa endo 1-4 xylanase từ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome. Tạp chí Sinh học 40(1): 39-50.
6. Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Đỗ Thị Huyền, Lê Tùng Lâm, Phùng Thị Lan, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải (2018) Thiết kế probe để khai thác gen mã hóa cho pectinesterase từ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome và đồng biểu hiện gen gpecs1 của vi khuẩn dạ cỏ dê với chaperone pG-KJE8 trong Escherichia coli. Tạp chí Sinh học. 40(1): 83-90.
7. Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Đỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải (2017) Xây dựng probe để khai thác và chọn gen mã hóa beta-glucosidse GH1 từ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome dạ cỏ dê. Tạp chí Y học Việt Nam. 458(đặc biệt): 190-197.
8. Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Lê Tùng Lâm, Phùng Thị Lan, Đỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải (2017) Nghiên cứu biểu hiện gen gpecs1 mã hóa pectinesterase khai thác từ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê trong tế bào Escherichia coli sử dụng vector pET22b(+). Tạp chí Y học Việt Nam. 458(đặc biệt): 197-203.
9. Nguyễn Thị Minh Thu, Đỗ Thị Huyền, Lưu Hàn Ly, Lê Tùng Lâm, Phùng Thị Lan, Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Trương Nam Hải (2017) Lựa chọn gen mã hóa cho cellobiose phosphorylase từ dữ liệu giải trình tự DNA metagenome và khai thác biểu hiện gen celp1 trong Escherichia coli. Kỷ yếu Hội nghị Khoa học Kỷ niệm 30 năm ngày thành lập Trung tâm nhiệt đới Việt-Nga. 378-387.
10. Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Đỗ Thị Huyền, Vũ Thị Ly, Nguyễn Hữu Đức, Trương Nam Hải (2017) Xây dựng probe để khai thác và chọn gen mã hóa beta-glucosidase GH3 từ dữ liệu giải tình tự DNA metagenome vi khuẩn dạ cỏ dê. Kỷ yếu Hội nghị Khoa học Kỷ niệm 30 năm ngày thành lập Trung tâm nhiệt đới Việt-Nga. 372-377.
11. Lê Ngọc Giang, Lê Tùng Lâm, Trần Thị Loan, Đỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải (2018) Nghiên cứu biểu hiện và tinh chế α-glucuronidase có nguồn gốc vi khuẩn dạ cỏ dê trong tế bào Esccherichia coli. Tạp chí Khoa học Tự nhiên và Công nghệ ĐHQG Hà Nội. 34(2): 1-8.

Các bằng sáng chế, giải pháp hữu ích (liệt kê):

1. Trương Nam Hải, Đỗ Thị Huyền, Đào Trọng Khoa (2017) Expansin tái tổ hợp có nguồn gốc từ vi khuẩn dạ cỏ dê hỗ trợ thủy phân cellulose tinh thể. Có giấy chấp nhận đơn.

Các sản phẩm cụ thể (mô tả sản phẩm, nơi lưu trữ):

- Cơ sở dữ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen của vi sinh vật trong dạ cỏ dê, đất xung quanh khu nấm mục trắng, cDNA của nấm thủy phân gỗ trong rừng được lưu trữ tại máy tính của phòng Kỹ thuật di truyền, dữ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen của vi khuẩn suối nước nóng Bình Châu được lưu trữ tại phòng Vật liệu sinh học, viện Công nghệ sinh học;
- Cơ sở dữ liệu trình tự gen mã hóa cho enzyme tham gia chuyển hóa lignocelluloses được lưu trữ tại máy tính của phòng Kỹ thuật di truyền, dữ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen của vi khuẩn suối nước nóng Bình Châu được lưu trữ tại phòng Vật liệu sinh học, viện Công nghệ sinh học;
- Trình tự gen mới (4090 trình tự) mã hóa cho enzyme tham gia chuyển hóa lignocellulose được khai thác từ dữ liệu DNA metagenome được lưu trữ tại phòngKỹ thuật di truyền và phòng Vật liệu sinh học, viện Công nghệ sinh học.
- Trình tự gen endoglucanase, xylan beta-xylosidase, 6-phospho beta glucosidase, beta-glucosidase trong vector tách dòng được lưu trữ tại phòng Kỹ thuật di truyền, viện Công nghệ sinh học;
- Năm chủng tái tổ hợp E. coli biểu hiện gen mã hóa enzyme endo xylanase, endo glucuronidase, endoglucanase kiềm, endoglucanase axit, beta glucosidase được lưu trữ tại phòng Kỹ thuật di truyền và phòng Vật liệu sinh học, viện Công nghệ sinh học.
- Năm vector biểu hiện pET22-gexl1, pET22-gglc1, pET17-egc1, pET17-egc2, pET17-bgc mang gen mã hóa enzyme chuyển hóa lignocellulose được lưu trữ tại phòng Kỹ thuật di truyền và phòng Vật liệu sinh học, viện Công nghệ sinh học.
- Năm enzyme bao gồm endo xylanase, endo glucuronidase, endoglucanase kiềm, endoglucanase axit beta glucosidase có độ sạch trên 85% được lưu trữ tại phòng Kỹ thuật di truyền và phòng Vật liệu sinh học, viện Công nghệ sinh học

Các sản phẩm khác (nếu có)

Bản quyền thuộc về Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Email: This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.
Khi phát hành lại thông tin trên Website cần ghi rõ nguồn: "Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam".