Nghiên cứu đánh giá và khai thác hoạt chất từ tảo biển

Chủ nhiệm đề tài TS. NCVC. Đặng Diễm Hồng
Đơn vị thực hiện Viện Công nghệ Sinh học
Thời gian thực hiện 2007 - 2008
Tổng kinh phí 250 triệu đồng
Mục tiêu đề tài

Nghiên cứu sâu hơn về hai loại chất có giá trị dược dụng là lectin và các axít béo không bão hòa mạch dài thuộc nhóm ω-3 và ω-6 từ tảo lớn và vi tảo được nuôi trồng và phân lập ở Việt Nam.

Nội dung đề tài

1. Lectin:

- Thu thập tảo biển và tiến hành chiết lectin.
- Tiến hành sàng lọc các chất có hoạt tính từ dịch chiết tảo thô và dịch chiết đã kết tủa protein đối với hệ máu người (ABO) và động vật (cừu, thỏ và gà) trong điều kiện có và không có xử lý enzyme.
- Xác định hoạt tính ngưng kết máu và nồng độ ngưng kết nhỏ nhất.
- Xác định hàm lượng protein. Qua đó chọn đối tượng có hoạt tính cao, nồng độ dính kết nhỏ nhất (đặc hiệu nhóm máu) để tiến hành thu thập số lượng lớn mẫu để tinh chế.
- Tinh chế lectin bằng phương pháp sắc ký gel và sắc ký trao đổi ion.
- Độ tinh khiết và trọng lượng phân tử của lectin được đánh giá bằng điện di SDS- PAGE trong điều kiện không khử và khử bằng 2-mercaptoethanol. Đánh giá tính chất hóa của lectin.
- Xác định đặc hiệu nhóm máu và nồng độ ngưng kết nhỏ nhất của lectin được tinh chế.
- Xác định ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, cation hóa trị hai đến hoạt tính ngưng kết máu của lectin được tinh chế.
- Xác định đặc tính liên kết cacbonhydrat của lectin được tinh chế (rất quan trọng để tìm ra hướng sử dụng điều trị bệnh). Nghiên cứu quy trình nuôi trồng đối tượng tảo biển đã được chọn để tách chiết lectin nghiên cứu như sau:
- Nghiên cứu mối quan hệ giữa hàm lượng lectin và các yếu tố môi trường bao gồm: độ sâu, cường độ ánh sáng, độ muối, pH, nhiệt độ và hàm lượng dinh dưỡng N, P và mùa trong năm.
- Mô hình nuôi trồng thử nghiệm quanh năm trong lồng với diện tích (10m x 10m), phụ thuộc theo độ sâu nước biển. Đánh giá hoạt tính sinh học bao gồm: Thử hoạt tính độc tế bào; hoạt tính phân bào đối với lympho bào người hoặc hoạt tính kháng virus, kháng ung thư, kháng khối u và một số hoạt tính sinh học khác.

2. Hoạt chất giàu axit béo không bão hòa đa nối đôi ω3 (DHA), ω6 (n-6DPA):
- Phân lập các chủng tảo biển Lapyrinthula hoặc Schizochytrium từ một số vùng biển khác nhau của Việt Nam, xây dựng bộ chủng giống về Lapyrinthula và Schizochytrium của Việt Nam;
- Sàng lọc nhanh chóng các chủng giống tảo biển Lapyrinthula hoặc Schizochytrium vừa có tốc độ sinh trưởng cao, vừa có hàm lượng DHA và n-6DPA cao;
- Tối ưu hóa điều kiện nuôi trồng của 1 hoặc 2 chủng Lapyrinthula và Schizochytrium lựa chọn được, xây dựng quy trình nuôi trồng các chủng này để thu sinh khối giàu DHA và n-6DPA.
- Xây dựng quy trình tách chiết hoạt chất giàu axit béo DHA và n-6DPA từ sinh khối Lapyrinthula và Schizochytrium.
- Xây dựng quy trình sấy phun khô sinh khối tươi giàu axit béo không bão hòa (DHA và n-6DPA), qui trình bao viên tạo viên thực phẩm chức năng.
- Nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên thực phẩm chức năng giàu axit béo DHA và n-6DPA trên động vật thực nghiệm. Nghiên cứu tác dụng sinh lý của viên thực phẩm chức năng trên động vật thực nghiệm hoặc người tình nguyện.
- Thiết kế mẫu mã và bao bì đóng gói cho viên thực phẩm chức năng giàu axit béo không bão hòa (DHA và n-6DPA).
- Thủ tục đăng ký cho viên thực phẩm chức năng giàu axit béo không bão hòa (DHA và n-6DPA).

Kết quả đạt được

-    Báo cáo tổng quan từ rong biển Việt Nam.
-    Đã tiến hành thu thập được 44 mẫu tảo biển Việt Nam bao gồm 15 mẫu tảo lục, 18 mẫu tảo đỏ và 11 mẫu tảo nâu: Định tên loài và bảo quản làm nguồn tách chiết lectin.
-    Đã tiến hành chiết 44 mẫu tảo biển Việt Nam bao gồm 15 mẫu tảo lục (Chlorophyta), 18 mẫu tảo đỏ (Rhodophyta) và 11 mẫu tảo nâu (Phaeophyta) trong đó hầu hết dịch chiết đều có hoạt tính của lectin trừ 3 mẫu Chlorophyta và 2 mẫu Rhodophyta.
-    Hoạt tính mạnh với hồng cầu cừu và thỏ được xử lý enzyme được phát hiện trong các dịch chiết từ 2 mẫu Chlorophyta (Anadyomene plicata and Avrainvillea erecta) và 4 mẫu Rhodophyta (Gracilaria eucheumatoides, G. salicornia, Kappaphycus alvarezii, và K. striatum).
-    Lectin từ 7 mẫu Chlorophyta và 8 mẫu Rhodophyta được kiểm tra cho đặc tính liên kết carbohydrate, khả năng bền nhiệt độ, pH và sự độc lập của cation hóa trị hai cho hoạt tính ngưng kết máu dùng các kết tủa ammonium sulfate từ dịch chiết thô.
+    Trong phép thử ức chế sự ngưng kết máu với các monosaccharide và glycoprotein khác nhau, tất cả các hemagglutinin đã không có ái lực cho monosaccharide, ngoại trừ hemagglutinin từ Codium adhaerens và G. euchematoides mà hoạt tính của chúng bị ức chế bởi N-acetyl-D-galactosamine và N-acetyl-D-glucosamine.
+    Tất cả các hemagglutinin đều bị ức chế hoạt tính bởi một số glycoprotein. Kiểu, dạng ước chế với glycoprotein là khác nhau và phụ thuộc vào từng mẫu tảo.
+    Hoạt tính của các hemagglutinin này bền trong một phạm vi rộng của nhiệt độ,  pH và sự độc lập cation hóa trị hai.
-    Đã đưa ra được quy trình nuôi trồng Kappaphycuss alvarezii quanh năm ở vịnh Cam Ram cho mục đích chiết lectin.
-    Thu thập các số liệu các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến hàm lượng và hoạt tính lectin, số liệu về tính chất hóa lý và hoạt tính sinh học của lectin.
-    Đã có được 10 mg lectin sạch tách chiết từ rong Sụn.
-    Báo cáo tổng quan tài liệu, phương pháp sàng lọc DHA, ω -6DPA ở rong tảo biển Việt Nam.
-    Danh mục tảo biển của Việt Nam giàu axit béo DHA, ω -6DPA.
-    Bộ chủng giống vi tảo biển giàu axit béo DHA và ω -6DPA  gồm 68 chủng Labyrinthula và 20 chủng Schizochytrium.
-    Đã tiến hành sàng lọc 68 chủng Labyrinthula, 20 chủng Schizochytrium từ đó chọn ra được 28 chủng Labyrinthula và 3 chủng Schizochytrium (PQ6, TH16, TB17) có tiềm năng cho những ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản và làm thực phẩm chức năng.
-    Đã đưa ra được quy trình nuôi sinh khối 2 chủng Labyrinthula (HP43 và ND 50) trong môi trường lỏng có sử dụng giá thể và quy trình nuôi sinh khối chủng Schizochytrium mangrovei PQ6 đạt sinh khối 20-30 g/l, lipít tổng số >50% TLK, axit béo tổng số chiếm hơn 90% lipít tổng số , hàm lượng DHA và ω-6DPA  chiếm > 50% axit béo tổng số.
-    Đã tách chiết thành công các axit béo không bão hòa có DHA và ω-6DPA từ axit béo tổng số trong sinh khối LabyrinthulaSchizochytrium với hiệu suất > 80%.
-    Đã đưa ra được quy trình sấy khô sinh khối và bao viên nang Algal Omega-3 từ sinh khối Schizochytrium.
-    Tạo được 14.000 viên Algal Omega- 3 để thử tiền lâm sàng trên động vật thực nghiệm và người tình nguyện.
-    Đã thử nghiệm độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên Algal Omega- 3 trên động vật chuột và thỏ thực nghiệm và kết luận rằng Algal Omega- 3 không độc theo đường uống và không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể, công thức máu ngoại vi, chức năng thận của thỏ thí nghịêm; giúp cho việc đáp ứng nhanh sự hình thành phản xạ và làm chậm quá trình dập tắt phản xạ ở chuột nhắt trắng; Ở chuột cống trắng, Algal Omega- 3 đã rút ngắn được thời gian đáp ứng tránh shock điện chủ động có điều kiện và số lần tập để có phản xạ bền vững và ít hơn. Ở chuột nhắt trắng đã bị gây suy giảm năng lực tâm thần kinh thì Algal Omega- 3 cũng giúp cho quá trình phục hồi nhanh khả năng phản xạ của chúng.
-    Đã thiết kế xong mẫu bao bì và đóng hộp viên thực phẩm chức năng.
-    Đang hoàn tất thủ tục đăng ký sản phẩm viên thực phẩm chức năng giàu axit béo không bão hòa (DHA và ω-6 DPA) tại Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm (Bộ Y tế).
-    Đã tiến hành thử nghiệm trên 30 người tình nguyện trong 1 tháng để đánh giá hiệu quả và sự dung nạp viên Algal Omega- 3  trong việc điều trị suy nhược thần kinh.
-    Đăng kí trình tự gen trên ngân hàng Quốc tế: 2 trình tự gen của hai chủng Schizochytrium sp. PQ6 và TH16; 1 trình tự gen của Labyrinthula sp. ND50 với số đăng ký tương ứng là EU728656, EU728657 và FJ53674.
Từ các kết quả nghiên cứu của đề tài, đã rút ra các kết luận như sau:

1. Lectin:

- Trong số 44 mẫu rong biển được kiểm tra cho hoạt tính ngưng kết máu, 12 mẫu rong lục, 16 mẫu rong đỏ và 11 mẫu rong nâu được phát hiện mới có chứa lectin. Nhìn chung, hoạt tính của các hemagglutinin đã bị ức chế bởi các glycoprotein mang N-glycan dạng high-mannose, dạng complex hoặc O-glycan, phụ thuộc vào nguồn gốc của mẫu. Vì vậy, rong biển ở Việt Nam là một nguồn đầy triển vọng để nghiên cứu lectin.
- Hàm lượng của lectin từ rong sụn -Kappaphycus alvarezii nuôi trồng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường, đặc biệt là nhiệt độ nước biển.
- Lectin rừ rong sụn -Kappaphycus alvarezii là protein dạng monomer với khối lượng phân tử khoảng 28.000 Da và đặc hiệu N-glycan dạng high mannose. Do vậy, rong sụn K.alvarezii đang được nuôi trồng rộng rãi ở nước ta không chỉ là nguồn carrageenan mà còn có thể là nguồn lectin có giá trị cho những ứng dụng trong hóa-sinh và y-sinh.

Nhận xét chung: Lectin từ rong biển có khối lượng phân tử nhỏ hơn khối lượng phân tử của lectin từ thực vật bậc cao. Vì vậy, có thể lectin từ rong biển phù hợp hơn cho việc sử dụng làm chất dẫn truyền thuốc so với lectin từ thực vật bậc cao vì có thể sẽ ít tạo thành kháng nguyên. Trước khi áp dụng vào mục đích này, những thông tin chi tiết như đặc tính liên kết chính xác của lectin với những glycoprotein có kích thước nhỏ và cấu trúc bậc một của chúng cần phải được xác định.

2. Axít béo không bão hòa:

- Xây dựng một tập đoàn giống Labyrinthula gồm 68 chủng phân lập từ 7 tỉnh (Hải Phòng, Quảng Ninh, Nam Định, Thái Bình, Thanh Hóa, Nghệ An và Kiên Giang) với các thông số về tốc độ sinh trưởng, hàm lượng lipít tổng số và axít béo không bão hòa.
- Phân lập thành công 20 chủng Schizochytrium từ 3 tỉnh (Phú Quốc- Kiên Giang, Thanh Hóa và Thái Bình) và chọn được 3 chủng Schizochytrium có tiềm năng ứng dụng là PQ6, TH16 và TB17 có tốc độ sinh trưởng, hàm lượng lipít tổng số và axít béo không bão hòa cao để lên men thu sinh khối lượng lớn.
- Đăng ký được 3 trình tự gen 18S rADN trên ngân hàng gen Quốc tế với số đăng kí là Schizochytrium mangrovei PQ6 (EU728656), Schizochytrium mangrovei TH16 (EU728657) và Labyrinthula sp. ND50 (FJ536742); - Quy trình lên men trong bình lên men 5 và 10 lít đã được tối ưu, sinh khối thu được là 23,70 và 25,34 g SKK/lít; năng suất DHA đạt 8,71 và 11,55 g/l, tương ứng. Đối với bình lên men tự tạo 30 lít, cần tiếp tục tối ưu hóa để có thể thu được sinh khối có hàm lượng lipit và axit béo cao. Thành phần dinh dưỡng của sinh khối Schizochytrium được nuôi bằng cao nấm men ngoại và cao công nghiệp là tương tự nhau.
- Đã có được quy trình tách chiết các axit béo không bão hòa DHA và ω-6 DPA từ sinh khối của Schizochytrium với hiệu suất tách chiết trên 80% tổng số axit béo.
- Tạo ra 14.000 viên thực phẩm chức năng Algal Omega- 3 từ sinh khối Schizochytrium giàu DHA để thử trên động vật thực nghiệm và hiện đang thử trên người tình nguyện.
- Kiểm tra về an toàn và hiệu lực của Algal Omega- 3 trên động vật thực nghiệm cho thấy:
+ Algal Omega- 3 ít độc, không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể, công thức máu ngoại vi, chức năng thận. Tuy nhiên, gây tăng nhẹ hoạt độ enzyme SGOT của gan, do vậy cần lưu ý khi sử dụng dài ngày.
+ Algal Omega- 3 có tác dụng tốt trong việc duy trì, làm chậm quá trình dập tắt phản xạ có điều kiện đã thiết lập; thời gian đáp ứng tránh shock ngắn; có tác dụng phục hồi khả năng phản xạ trên động vật thực nghiệm bị gây suy giảm năng lực tâm thần kinh. - Đánh giá hiệu quả và sự dung nạp của viên thực phẩm chức năng Algal Omega- 3 trong điều trị suy nhược thần kinh.
+ Viên thực phẩm chức năng Algal Omega- 3 có tác dụng điều trị bệnh nhân có hội chứng suy nhược thần kinh, đặc biệt thuốc có hiệu quả rõ rệt đối với các triệu chứng đau đầu; mệt mỏi; rối loạn giấc ngủ và hay quên. Ngoài ra, trí nhớ ngắn hạn, khả năng tập trung và di chuyển; chú ý tăng rõ rệt sau đợt điều trị; cải thiện điện não (tăng chỉ số và biên độ sóng α, giảm chỉ số và biên độ sóng β) và không ảnh hưởng tới hoạt động hệ tim - mạch.
+ Về khả năng dung nạp thuốc: Algal Omega- 3 được dung nạp tốt, không gây tác dụng phụ đáng kể; không ảnh hưởng đến chức năng tuần hoàn, máu, gan, thận và chuyển hóa lipít sau một tháng điều trị. Các thông số như tần số mạch, huyết áp động mạch, số lượng hồng cầu, huyết sắc tố, số lượng bạch cầu, hàm lượng SGOT, SGPT, Bilirubin, Ure, Creatinin, Cholesterol, Triglycerid chưa thấy có biến đổi.

Kết quả đào tạo:

 

  • 01 sinh viên đã bảo vệ thành công khóa luận tốt nghiệp 6/2008.
  • 03 học viên cao học đã bảo vệ thành công vào tháng 12/2007 và 12/2008 (tại Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật).
  • Đóng góp đào tạo 01 nghiên cứu sinh năm thứ nhất.

Bản quyền thuộc về Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Email: This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.
Khi phát hành lại thông tin trên Website cần ghi rõ nguồn: "Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam".