Nghiên cứu sự đa hình phân tử và khả năng thể hiện hoạt tính cytotoxin và các hoạt tính sinh học khác của ribonuclease (RNase) từ nọc độc của rắn sống ở Việt Nam. Mã số nhiệm vụ: VAST.HTQT.NGA.07/15-16

Chủ nhiệm đề tài PGS.TS. Nguyễn Văn Thiết
Đơn vị thực hiện Viện Công nghệ Sinh học
Thời gian thực hiện 2015 - 2016
Thuộc chương trình Quỹ NCCB Nga
Cán bộ tham gia Chủ nhiệm nhiệm vụ phía phía đối tác: TS. Alexey V. Đơn vị chủ trì phía đối tác: Viện Hóa sinh hữu cơ mang tên các Viện sỹ M.M. Shemyakin & Yu.A. Ovchinnikov thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Nga
Tổng kinh phí 200
Xếp loại đề tài Xuất sắc
Mục tiêu đề tài

Mục tiêu chính của nhiệm vụ là nghiên cứu một số tính chất sinh học của RNase từ nọc rắn hổ mang (Naja atra) của Việt Nam nhằm:
- Tìm hiểu vai trò của enzyme này trong tác động độc chung của nọc rắn; và
- Đánh giá khả năng thể hiện hoạt tính gây độc tế bào (hoạt tính cytotoxin) và một số hoạt tính sinh học khác (như hoạt tính kháng khuẩn, chống virus…) của RNase trong nọc rắn, nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác và sử dụng một cách hiệu quả nguồn dược liệu cổ truyền quý này phục vụ nhu cầu chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

Kết quả đạt được

1. Kết quả nghiên cứu sự đa hình phân tử của RNase nọc rắn: Đã phát hiện được:
- 4-5 dạng phân tử của RNase khác nhau về kích thước (xác định bằng sắc kí lọc gel), theo thứ tự ra khỏi cột được kí hiệu là RNase I hay Ia & Ib, II, III và IV;
- 8-10 isoform của nọc rắn khác nhau về điện tích bề mặt (phát hiện được bằng phương pháp sắc kí trao đổi ion);
- 19 isoform của RNase khác nhau về tính kị nước chỉ riêng trong đỉnh RNase IV từ cột Sephadex G50sf (phát hiện được bằng phương pháp HPLC pha ngược). Nếu tính cả 3 đỉnh RNase I, II và III phân tách ra được trên cột G50sf, thì trong nọc rắn hổ mang Việt Nam có ít nhất 22 isoform RNase khác nhau.
Như vậy, đã xác định được ít nhất 4 nguyên nhân gây ra sự đa hình phân tử của RNase từ nọc rắn hổ mang Việt Nam:
a) Sự khác nhau về kích thước phân tử;
b) Sự khác nhau về điện tích bề mặt;
c) Sự khác nhau về tính kị nước, và
d) Tổ hợp của các yếu tố này.
2. Đã xác định được khối lượng phân tử (MW) của một số dạng/isoform RNase bằng các phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử (hay sắc kí lọc gel), điện di trên gel polyacrylamide và MALDI mass-spectra (xem bảng):
Khối lượng phân tử của một số isoform RNase xác định bằng các phương pháp khác nhau:

nvthiet3

3. Các kết quả nghiên cứu cấu trúc cho thấy các isoform RNase P4-20 và P3-21 có họ hàng với PLA2 nọc rắn và thuộc loại RNase A, trong đó isoform P4-20 tương đồng 58% với các PLA2, còn isoform P3-21 chỉ tương đồng 23% với PLA2.
Từ so sánh với cơ sở dữ liệu đã xác định được: isoform P6-27 tương đồng 78% với cytotoxin I và tương đồng với các toxin ba ngón khác tới 46-70%, trong đó có cả neurotoxin ngắn; isoform P4-31 tương đồng với neurotoxin ngắn từ nọc rắn hổ mang Trung Quốc tới 74%. P4-34 và P3-36 giống cytotoxin KJC3 tới 97% và 93%, tương ứng! Các isoform P6-27, P4-31, P4-34 và P3-36 thuộc nhóm toxin ba ngón.
Các isoforms H19-1, H19-2 & H19-3 và H19-a, H19-b & H19-c (với MW ~ 7 kDa) cũng thuộc loại toxin ba ngón và là các homolog gần của neurotoxin II mạch ngắn từ nọc rắn hổ mang vùng Trung Á Naja oxiana.
4. Các kết quả nghiên cứu động học đã chỉ ra rằng RNase nọc rắn hổ mang Việt Nam có thể có hoạt tính cytotoxin, bởi vì enzyme này có độ bền cấu hình rất cao và (các dạng RNase III & RNase IV của nó) không bị ức chế bởi RI (protein nôi bào ức chế RNase).
6 isoform P4-20, P3-21, P6-27, P4-31, P4-34 và P3-36 có độ sạch cao đã được thử nghiệm trên 3 dòng tế bào ung thư. Kết quả thử nghiệm cho thấy isoform  P4-34 có hoạt tính cytotoxin cao nhất, được thể hiện trên cả 3 dòng tế bào ung thư PC12, Neuro2a và mcf7.
Trong 6 isoform RNase kể trên, 3 P6-27, P4-31 và P3-36 có khả năng gây phân hóa các tế bào ung thư dòng PC12 thành các tế bào giống tế bào thần kinh.
7. Lần đầu tiên phát hiện được neurotoxin II có hoạt tính RNase. Kết quả điện di trên gel polyacrylamide cho thấy RNA đã bị thủy phân hoàn toàn bởi neurotoxin II, còn theo kết quả sắc kí sàng lọc phân tử: đỉnh của đường cong sản phẩm thủy phân RNA bị dịch chuyển về bên phải sắc kí đồ, tức là về phía khối lượng phân tử nhỏ hơn, điều này chứng tỏ RNA đã bị thủy phân bởi neurotoxin II.

Hình ảnh của đề tài:

nvthiet1

nvthiet2

Những đóng góp mới

- Phát hiện được một loại RNase mới trong nọc rắn hổ mang Việt Nam, khác với loại RNase ngoại tiết kinh điển (dạng RNase II với MW 12-14 kDa có họ hàng với PLA2 của nọc rắn và có mặt trong tất cả các loại nọc rắn) ở 2 điểm: (1) có MW rất thấp (6-9 kDa), và (2) có hoạt tính ribonucleolytic cao. Theo kết quả sắc kí sàng lọc phân tử, loại RNase mới này có 2 dạng khác nhau về MW, đó là RNase III (MW 8-9 kDa) và IV (MW ~ 6 kDa). Còn theo kết quả phân tách trên các cột HPLC và trao đổi ion, loại RNase mới có nhiều isoform khác nhau về thời gian lưu cột và điện tích bề mặt.
- Phát hiện mới đặc biệt quan trọng là loại RNase mới này có bản chất là toxin và, như là hệ quả, lần đầu tiên đã phát hiện được rằng neurotoxin II từ NRHM vùng Trung Á N. oxiana có hoạt tính RNase, điều này góp phần khẳng sđịnh bản chất toxin của các isoform/dạng RNase từ NRHM  Việt Nam với MW thấp.
- Đã xác định được MW chính xác của 4 isoform RNase là: 6806,0 (S23-34-28); 6953,6 (S13-19-19.2-2); 7601,1 (S32-21-38.3) và 7606,7 Da (S33-28-28.4-26).
- Phát hiện được isoform RNase P4-34 có hoạt tính cytotoxin đối với các dòng tế bào ung thư PC12, Neuro2a và mcf7.
- Phát hiện được các isoform RNase P6-27. P4-31 và P3-36 có hoạt tính phân hóa tế bào ung thư dòng PC12 thành các tế bào giống tế bào thần kinh.

Sản phẩm

- Các bài báo đã công bố (liệt kê)
1) Осипов А.В., Нгуен В.Т. Аномальное распределение рибонуклеазной активности в яде Вьетнамской разновидности кобры Naja naja. Actualscience 2016, Том 2, N 1 (6), c. 5-6.  
2) Nguyen Van Thiet, Osipov A. A study of ribonuclease activity in venom of Vietnam cobra. Journal of Animal Science and Technolopgy (2017) 59:20. DOI 10.1186/s40781-017-0145-5 (Received: 8 March 2017 Accepted: 22 June 2017 Published online: 25 September 2017).
3. Осипов А.В. , Нгуен В.Т., Куaх Т.Л., Зиганшин Р.Х., член-корреспондент РАН Цетлин В.И., Уткин Ю.Н. Нейротоксин II из яда кобры Naja oxiana взаимодействует с РНК. Доклады Aкадемии наук.  (В прессе).
4) Nguyen Van Thiet, Quach Thi Lien, Osipov A. Molecular polymorphism of ribonuclease from venom of Vietnam cobra. Proceedings of Scientific workshop “Progress and Trends in Science and Technology” commemorating 10 years of Partnership between the Vietnam Academy of Science and Technology and the Russian Foundation for Basic Research. Hanoi, February 2016. Thế giới Publishers, ISBN: 978-604-77-2226-6, p.371-379.
5) Nguyễn Văn Thiết, Quách Thị Liên, Osipov A. Sự đa hình phân tử của ribonuclease nọc rắn hổ mang. Báo cáo Khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ hai Hệ thống bảo tàng thiên nhiên Việt Nam. Hà Nội, tháng 3/2016. Nxb Khoa học tự nhiên và Công nghệ. ISBN: 978-604-913-440-1. tr. 631-639.
6) Nguyễn Văn Thiết, Đỗ Trung Sỹ. Kết quả phân tách ribonuclease nọc rắn hổ mang trên cột CM-cellulolose thực hiện trên thiết bị FPLC. T/c Dược liệu, số 1+2/2016, tr. 111-116.

Kiến nghị

Trong qua? tri?nh th?c hi?n nhi?m v? HTQT này, chúng tôi ?ã xây d?ng ???c m?i quan h? h?p tác r?t t?t v?i các ??ng nghi?p Nga. Nhi?m v? ?ã ??t ???c nhi?u k?t qu? m?i quan tr?ng, có nhi?u ?óng góp m?í, ??c bi?t là phát hi?n ???c b?n ch?t toxin c?a các d?ng c?a lo?i RNase m?i trong n?c r?n h? mang Vi?t Nam – d?ng RNase III và IV (các d?ng RNase v?i MW th?p và các isoform c?a chúng), và phát hi?n ra ho?t tính RNase c?a neurotoxin II, mà phía b?n coi là m?t phát minh l?n trong toxin h?c và phía b?n mu?n ti?p t?c h?p tác ?? nghiên c?u các v?n ?? khoa h?c n?y sinh liên quan ??n phát minh này. V?y ?? ngh? Ban HTQT và Lãnh ??o Vi?n Hàn lâm ?ng h? ?? vi?c h?p tác nghiên c?u này ???c ti?p t?c trong th?i gian t?i (có th? ?? ngh? ti?p t?c h?p tác nghiên c?u c?a phía ??i tác).

Bản quyền thuộc về Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Email: This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.
Khi phát hành lại thông tin trên Website cần ghi rõ nguồn: "Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam".