Nghiên cứu cơ bản

Nghiên cứu tạo phức hợp kháng thể + hạt nano silica phát quang để phát hiện nhanh vi khuẩn gây bệnh

.

Trong số các loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, E.coli O157:H7 được xem là rất nguy hiểm với liều gây độc thấp (10-100 tế bào). Người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện chúng như: đếm tế bào dưới kính hiển vi, đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch, miễn dịch học bằng enzym, đầu dò enzym, ELISA, kít chuẩn PCR. Phương pháp phát hiện E.coli O157:H7 trong thực phẩm mang tính pháp lý ở Việt Nam là sử dụng kỹ thuật làm giầu, xác định khuẩn lạc nghi ngờ E.coli O157:H7 trên đĩa thạch SMAC sau khi ủ ấm ở 37oC trong 24 giờ. Từ những khuẩn lạc nghi ngờ, tiến hành kiểm tra các tính chất sinh hóa và ngưng kết đặc hiệu để khẳng định là E.coli O157:H7. Tuy nhiên, tất cả các phương pháp nêu trên đều không thể phát hiện chính xác số lượng vi khuẩn ở nồng độ thấp. Để khắc phục nhược điểm nêu trên, người ta đã và đang ứng dụng các loại vật liệu nano phát quang như hạt silica chứa tâm màu hay chấm lượng tử QD chứa các nhóm chức năng sinh học trên bề mặt như một chất đánh dấu huỳnh quang để phát hiện nhanh và chính xác số lượng vi khuẩn gây bệnh thực phẩm bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang. Khâu cốt lõi của kỹ thuật sử dụng hạt nano silica chứa tâm màu là việc chế tạo ra được phức hợp giữa kháng thể đặc hiệu vi khuẩn đích với hạt silica phát quang bền vững.

Phức hợp hạt nano silica + kháng thể đặc hiệu có thể được tạo ra bởi nhiều cơ chế khác nhau. Theo các tác giả người Mỹ Xing Y và cộng sự (2008), thì hiện nay có 5 cách để tạo ra phức hợp này là: gắn kết trực tiếp thông qua liên kết amine–carboxylic; sử dụng SMCC làm xúc tác tạo cặp sulfhydryl-amine; gắn kết trực tiếp thông qua các nhóm carbon-hydrate bị oxy hóa trên phần Fc của kháng thể; gắn kết các peptide được gắn histidine hoặc các kháng thể lên các chấm lượng tử được Ni-NIA hóa; gắn kết không hóa trị của hạt nano silica được bọc streptavidin với các kháng thể được biotin hóa biotinylated. Mỗi kiểu gắn kết có những ưu điểm và hạn chế riêng. Nhưng nhìn chung, càng nhiều cầu nối trung gian giữa kháng thể và hạt nano chứa tâm màu phát quang càng làm cho phức hợp bền vững hơn và kháng thể không mất hoạt tính lâu hơn.

Sau khi tạo được phức hợp kháng thể đặc hiệu + hạt nano silica, tiến hành kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang để phát hiện và xác định số lượng vi khuẩn đích. Có nhiều cách phát hiện vi khuẩn đích như: quan sát và đếm trực tiếp các tế bào vi khuẩn phát quang dưới kính hiển vi huỳnh quang; xác định số lượng vi khuẩn (VK) đích bằng đường chuẩn giữa cường độ phát quang của VK gắn hạt nano và số lượng VK trong dung dịch chuẩn. Cường độ phát huỳnh quang là hàm số f của số lượng tế bào vi khuẩn đích trong mẫu.

Thực hiện đề tài độc lập cấp nhà nước: “Nghiên cứu ứng dụng các hạt nano phát quang vào việc đánh dấu tế bào để xác định số lượng vi khuẩn gây độc trong thực phẩm” do PGS.TS. Tống Kim Thuần làm chủ nhiệm, các nhà khoa học thuộc Viện Công nghệ Sinh học, Viện Vật lý, Viện Khoa học Vật liệu bước đầu đã chế tạo thành công phức hợp kháng thể đặc hiệu vi khuẩn đích + hạt nano silica bằng cách gắn trực tiếp các phân tử kháng thể lên bề mặt hạt silica thông qua liên kết amine–carboxylic với sự có mặt của chất xúc tác EDAC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride) trong các điều kiện sau: EDAC/1 phản ứng là 0,9mg; tỉ lệ kháng thể với hạt silica là 40/1; thời gian phản ứng hợp sinh 3 giờ có lắc ngang, nhiệt độ ủ ở 300C.

Phức hợp kháng thể và hạt silica được tạo thành này có khả năng nhận biết và liên kết đặc hiệu với vi khuẩn đích E. coli O157:H7 trong vòng 20 phút, tỉ lệ vi khuẩn đích gắn phức hợp và phát quang đạt > 60% và sau 3 ngày vẫn phức hợp vẫn giữ nguyên hoạt tính. Giới hạn phát hiện của kỹ thuật này đối vối vi khuẩn đích là 102 CFU/ml, thời gian phát hiện nhanh hơn các phương pháp thông thường nhiều lần.

1.        2.
Ảnh 1: TEM E. coli O157:H7 được bao bọc bởi phức hợp kháng thể + hạt silica
Ảnh 2: SEM E. coli O157:H7 được bao bọc bởi phức hợp kháng thể + hạt silica

Hình ảnh SEM (kính hiển vi quét) và kính hiển vi đồng tiêu của tế bào E.coli O157:H7 được đánh dấu bởi phức hợp kháng thể + hạt nano silica đã chứng minh rằng phức hợp này có thể bao bọc đều hoàn toàn và như nhau lên bề mặt tế bào vi khuẩn. Qua đó có thể khẳng định các hạt nano silica hợp sinh với kháng thể vẫn giữ nguyên tính chất phát quang hiệu quả và các phân tử kháng thể khi gắn với hạt nano silica vẫn giữ được hoạt tính và có khả năng nhận biết và liên kết với vi khuẩn đích.

Như vậy, lần đầu tiên ở Việt Nam, các nhà khoa học đã ứng dụng thành công các hạt nano phát quang vào việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh thực phẩm bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang.


Ảnh huỳnh quang: (a) phức hợp hạt nano silica – kháng thể; (b) VK gắn với phức hợp kháng thể - Silica; (c) VK gắn với phức hợp kháng thể - QDs


 
Phổ huỳnh quang của phức hợp hạt silica – kháng thể gắn kết với vi khuẩn E. coli O157:H7.
Đây là cơ sở để xây dựng đường chuẩn: cường độ phổ - số lượng E.coli O157:H7
để phát hiện nhanh, nhậy số lượng vi khuẩn này ở mật độ thấp

Ảnh huỳnh quang phức hợp Silica – E. coli O157:H7:
chụp bằng kính hiển vi đồng tiêu Nikon C1plus – Ti-E.
Viền màu đỏ bao bọc xung quanh tế bào vi khuẩn là phức hợp hạt silica + kháng thể đặc hiệu.


Cung cấp tin: PGS.TS.Tống Kim Thuần
– Viện Công nghệ Sinh học
Xử lý tin: Minh Tâm

 

Bản quyền thuộc về Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Địa chỉ: 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Email: This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.
Khi phát hành lại thông tin trên Website cần ghi rõ nguồn: "Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam".